敲低核纤层蛋白B1通过抑制PI3K/AKT通路在肝癌中发挥抑癌作用

作者：展沙沙; 范琪琪; 李雪^*

来源：中国肝脏病杂志(电子版), 2023, 15(03): 6-15.

• 肝癌
• 核纤层蛋白B1
• PI3K/AKT信号转导通路

目的 探讨核纤层蛋白B1(lamin B1,LMNB1)对肝癌进展的影响，发掘肝癌新的治疗靶点。方法 利用工具网站基因表达水平值的交互式分析平台（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）分析癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中肝癌组织及癌旁组织LMNB1的表达水平，使用Kaplan-Meier分析LMNB1表达水平差异对肝癌患者预后的影响。采用实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测正常肝细胞系及肝癌细胞系中LMNB1表达水平。选取LMNB1表达水平较高的两种人肝癌细胞株Hep3B、HepG2，转染小干扰RNA敲低LMNB1表达，在LMNB1表达水平较低的细胞SUN475中构建LMNB1稳定过表达细胞系并使用Western blot验证转染效率，采用CCK8法检测敲低或过表达LMNB1后肝癌细胞的增殖能力，采用平板克隆形成检测敲低或过表达LMNB1后细胞形成克隆的能力。采用Transwell检测敲低或过表达LMNB1后细胞侵袭及迁移能力的变化。采用Western blot实验检测磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinases,p-ERK）及细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）的变化。结果 TCGA数据库分析表明肝癌组织中LMNB1表达水平较癌旁正常组织高（P <0.05），且LMNB1表达水平与肝癌患者预后呈负相关（P=0.003）。实时定量PCR显示相对正常人肝细胞系，肝癌细胞中LMNB1 mRNA表达量分别为MHCC97H:1.80±0.10(t=11.08,P <0.001);SUN475:1.29±0.03(t=5.88,P=0.004);HepG2:2.97±0.04(t=39.68,P <0.001);PLC/Prf/5:1.74±0.04(t=14.51,P <0.001);HuH7:1.70±0.02(t=15.22,P <0.001);SK-HEP-1:1.59±0.05(t=11.17,P <0.001);Hep3B:2.27±0.09(t=18.50,P <0.001)；均显著高于正常人肝细胞系。Westernblot结果显示在HepG2及Hep3B细胞系中，与siScramble阴性对照组相比，转染siLMNB1实验组的LMNB1表达水平显著降低（HepG2:0.60±0.10 vs 1.60±0.10,t=11.55,P <0.001;Hep3B:0.40±0.10 vs 1.70±0.10;t=15.61,P <0.001）；而SUN475中转染质粒后LMNB1表达显著增加（0.70±0.20 vs 0.07±0.04;t=5.541,P=0.005）。敲低LMNB1后培养96 h，与对照组相比，Hep3B(10.81±0.67 vs 15.48±0.62;t=8.86,P <0.001)及HepG2(9.45±0.61 vs17.08±0.75;t=13.67,P<0.001)细胞增殖能力被显著抑制；而在SUN475中过表达LMNB1后，实验组细胞增殖活性显著增加（16.94±1.52 vs 12.65±1.06;t=3.99,P=0.016）。在HepG2及Hep3B细胞系中敲低LMNB1后，细胞克隆形成数显著减少[HepG2:(90.30±7.24)个vs (382.01±25.27)个，t=19.24,P <0.001;Hep3B:(128.03±8.24)个vs (395.85±28.27)个，t=15.76,P <0.001]，在SUN475中过表达LMNB1组比对照组克隆形成个数显著增加[（467.82±42.45）个vs (85.31±15.32)个；t=14.87,P=0.001]。在HepG2及Hep3B细胞系中敲低LMNB1后，肝癌细胞迁移数量显著减少[HepG2:(75.25±8.10)个vs (15.02±3.50)个，t=11.90,P <0.001;Hep3B:(168.20±12.26)个vs(34.83±7.61)个，t=15.96,P<0.001]，侵袭的细胞数量同样显著减少[HepG2:(110.21±12.01)个vs (25.76±4.03)个，t=11.50,P <0.001;Hep3B:(150.22±15.16)个vs (22.03±14.26)个，t=10.65,P <0.001]；在SUN475中，过表达LMNB1组比对照组细胞迁移数量显著增加[（50.11±5.55）个vs (349.85±25.26)个；t=11.33,P <0.001]，侵袭的细胞数量同样显著增加[（40.11±5.26）个vs (80.13±12.20)个；t=5.21,P=0.007]。与对照组相比，敲低LMNB1后，AKT的磷酸化活性形式p-AKT表达水平显著下降，而过表达LMNB1可导致p-AKT表达升高（P均<0.05）。而敲低或过表达LMNB1后，p-ERK表达水平无显著变化，AKT和ERK的本底表达水平均未发生明显变化。结论 抑制LMNB1可通过抑制PI3K/AKT信号转导通路的激活抑制肝癌的发生发展，可作为诊断肝癌的生物标记物和潜在的治疗靶点。

• 出版日期2023