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摘要
目的原核表达埃可病毒6型表面特异性蛋白VP1,并制备其多克隆抗体。方法筛选VP1蛋白氨基酸序列中抗原性强的片段,优化基因序列,分别构建重组表达质粒p GEX-4T-2-vp1和p ET-28a-vp1。将经双酶切及测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,进行15%SDS-PAGE鉴定。将融合蛋白VP1-GST及VP1-His分别用Glutathione resin和High Affinity Ni-NTA resin进行纯化。以纯化后的VP1-His融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,以VP1-GST融合蛋白为检测抗原,间接ELISA法检测血清抗体效价,Western blot法检测血清抗体特异性。结果经双酶切及测序鉴定证明,重组质粒p GEX-4T-2-vp1和p ET-28a-vp1构建正确。VP1-GST和VP1-His融合蛋白的相对分子质量分别为38 000和19 000,两种融合蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体形式表达,约占菌体总蛋白的60%和30%,纯化后的纯度均>90%。兔抗VP1血清效价为1∶320 000,可与融合蛋白VP1-GST和VP1-His发生特异性结合。结论成功原核表达了融合蛋白VP1-His和VP1-GST,且VP1-His具有良好的免疫原性,其制备的多克隆抗体的特异性较好,为埃可病毒快速检测技术的建立奠定了基础。
