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摘要
目的探讨microRNA-136(miR-136)对静脉平滑肌细胞增殖、迁移的影响及其作用机制。方法建立大鼠颈总动脉自体移植静脉模型,并于体外培养静脉平滑肌细胞。采用CCK(cell counting kit)-8和EDU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)实验检测细胞增殖情况,Transwell和细胞划痕实验检测细胞迁移情况,荧光定量PCR检测移植1、2、4周后和体外培养静脉平滑肌细胞中miR-136的相对表达量,免疫印迹法检测Steap3蛋白质表达量,免疫荧光法检测蛋白Steap3在细胞内的定位情况。通过microRNAs专业网站预测筛选可能的下游基因,并利用双荧光素酶报告基因验证。结果荧光定量PCR结果显示,移植1、2周后移植静脉miR-136的相对表达量分别为0.46±0.33、0.37±0.30,显著低于对侧未处理静脉(P值分别<0.05、0.01);移植4周后移植静脉miR-136的相对表达量为1.39±0.82,与对侧未处理静脉的差异无统计学意义(P>0.05);处于增殖状态的静脉平滑肌细胞中miR-136的相对表达量为0.11±0.01,显著低于处于非增殖状态的细胞(P<0.05)。CCK-8实验结果显示,阴性对照(NC)+血清组的光密度(D)值为0.96±0.03,显著高于NC组的0.62±0.02和模拟物+血清组的0.76±0.08(P值均<0.05)。EDU实验结果显示,NC+血清组EDU标记的阳性细胞百分比为(52.71±2.57)%,显著高于NC组的(13.91±3.43)%和模拟物+血清组的(32.56±3.26)%(P值均<0.01)。Transwell实验结果示,NC+血清组细胞迁移数为(53.13±16.36)个/视野,显著多于NC组的(8.09±5.44)个/视野和模拟物+血清组的(8.08±0.85)个/视野(P值均<0.05);细胞划痕实验结果显示,NC+血清组细胞24h迁移率为(45.40±1.17)%,显著高于NC组的(19.27±0.31)%和模拟物+血清组的(22.36±5.55)%(P值均<0.01)。免疫印迹法检测结果显示,NC+血清组的Steap3蛋白质相对表达量为0.91±0.07,显著高于NC组的0.52±0.10和模拟物+血清组的0.15±0.01(P值均<0.01)。免疫荧光染色结果显示,Steap3蛋白质主要定位于细胞质,NC+血清组的Steap3免疫荧光强度显著高于NC组和模拟物+血清组。双荧光素酶报告基因检测结果显示,野生型组的荧光素酶活性为1.59±0.21,显著低于对照组的4.39±0.92和突变型组的4.51±1.12(P值均<0.01),而对照组与突变型组的荧光素酶活性的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 miR-136可能通过靶基因Steap3抑制静脉平滑肌细胞增殖和迁移,其有望成为抑制移植静脉内膜新生的潜在治疗靶点。
