柯萨奇病毒A组10型抗原双抗体夹心ELISA定量方法的建立及应用

作者：鲁卫卫; 郭会杰; 刘善茹; 郝春生; 杨永娟; 张中洋^*; 李秀玲^*

来源：国际生物制品学杂志, 2022, 45(06).

• 柯萨奇病毒
• 抗体, 单克隆
• 酶联免疫吸附测定
• 手足口病
• 抗原
• 双抗体夹心法
• 定量分析

目的建立柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10, CV-A10)抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法, 用于CV-A10生产过程样品和四价手足口病疫苗的质量控制。方法以纯化的CV-A10抗原分别免疫绵羊和小鼠获得羊免疫血清和杂交瘤单克隆抗体(单抗)细胞株, 以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备腹水, 羊血清和小鼠腹水分别经亲和层析后获得纯化羊抗CV-A10多克隆抗体(多抗)和小鼠抗CV-A10单抗。采用微量细胞病变法测定纯化多抗和单抗中和抗体效价。分别以纯化羊多抗作为包被抗体、小鼠单抗作为检测抗体, 进行配对筛选研究, 建立CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA;对方法的线性、专属性、准确度、精密度、范围进行验证, 并对CV-A10抗原生产过程中的样品和成品进行检测。结果纯化抗CV-A10单抗和多抗均具有中和抗体活性。以多抗作为包被抗体、7株单抗作为检测抗体进行配对, 其中5株单抗配对成功, 选择CY166-14R作为检测抗体用于CV-A10抗原定量检测ELISA的建立;对检测方法进行优化, 确定以羊多抗作为包被抗体的使用稀释比例为1∶5 000～1∶10 000、小鼠单抗检测抗体稀释比例1∶2 000～1∶4 000。建立的CV-A10抗原定量检测方法范围为0.42～10.00 U/ml, 线性决定系数≥0.99;该方法仅能特异性检测CV-A10抗原, 与其他抗原或物质(肠道病毒71型、CV-A6、CV-A16、M199、DMEM、Vero细胞蛋白、牛血清)无交叉反应;对高、中、低浓度样品进行测定, 测定值/理论值在95%～110%之间, 相对标准偏差在15%以内。结论建立了CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA, 该方法在一定范围内的线性、专属性、准确度、精密度均较好, 可用于CV-A10抗原生产过程样品和成品的质量控制, 为CV-A10抗原的体外效力评价提供方法学基础。

• 出版日期2022
• 单位上海生物制品研究所有限责任公司