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摘要
目的研究重组产朊假丝酵母尿酸酶的高效表达条件、分离纯化和部分酶学性质。方法选择在菌体对数生长末期加入诱导剂,通过摇瓶培养对异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)和乳糖诱导产酶的效果进行比较;利用50 L发酵罐研究诱导培养时间;通过Ni-琼脂糖凝胶柱亲和层析、Sephacryl S-200 HR层析纯化目的蛋白并研究其最适pH值和酸碱稳定性、最适温度及热稳定性。结果摇瓶培养结果显示乳糖诱导效果优于IPTG。发酵罐培养工程菌,在对数生长末期添加乳糖诱导7 h后酶活力和生物量均达到最大值,分别为164 U/g菌体和23 g菌体/L发酵液,即每升发酵液含酶活性3 772 U。纯化的尿酸酶比活性为4.5 U/mg,其最适pH值为7.5,最适温度40℃,酸碱稳定范围在pH值6.010.0,温度低于45℃时热稳定性较好。结论以乳糖作为诱导剂培养效果更佳;带有His标签的重组尿酸酶经Ni-琼脂糖凝胶柱亲和层析和Sephacryl S-200HR分子层析后即可获得纯品,纯化流程更为简单;该纯化酶的最适反应温度、最适pH值、酸碱稳定性和热稳定性的确定为其结构与功能的关系以及未来的实际应用提供了一定的实验依据。
