大肠杆菌cDNA文库的构建与质量分析

作者：肖业; 王婷婷; 向双林

来源：湖南师范大学自然科学学报, 2016, 39(04): 29-33.

• 大肠杆菌
• 细菌双杂交
• cDNA文库

采用Stratagene公司的cDNA文库构建试剂盒构建大肠杆菌的cDNA文库,从中筛选出与RNaseⅢ有相互作用的蛋白,为研究RNaseⅢ蛋白在原核生物中的作用奠定基础.用Trizol试剂提取大肠杆菌的总RNA,在E.coli poly(A)Polymerase作用下给mRNA特异性地加上poly(A)尾,分离纯化mRNA,利用mRNA作为模板反转录合成双链DNA.经pfx酶补平双链末端,在两端加上EcoRⅠ接头,XhoⅠ酶切消化产生粘性末端.用CHROMA SPIN-400column分级分离纯化cDNA片段,与p TRG XR载体连接后,电击转入XL1-BLUE MRF’菌电转感受态中.得到原始文库,经计算文库的容量达到3×106个克隆.用PCR方法测得文库的重组率为100%,插入片段的平均长度基本位于300 bp以上,测定放大文库的滴度为:3.15×1010pfu/m L.说明构建的大肠杆菌cDNA文库质量比较高,适合用于筛选目的基因克隆.

• 出版日期2016
• 单位湖南师范大学; 生命科学学院