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摘要
目的探讨Smurf2对增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1/Smad信号转导通路负向调节因子Smad7的影响及调控机制。方法标本来自暨南大学附属广州市红十字会医院2014年1月至10月收治的8例需要手术的增生性瘢痕患者,年龄1岁8个月至7岁,瘢痕增生的时间在2～12个月,以同一患者术中剩余正常皮肤作为对照。采用组织块培养法分离后传代培养人增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞,取第3～5代细胞进行实验。①采用蛋白质印记法检测2组细胞中Smad7的蛋白表达水平;②加入外源性TGF-β1(10 ng/ml)作用0 min、5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、12 h后,采用RT-PCR和蛋白质印记法分别检测2组细胞中Smad7的mRNA和蛋白表达水平;③收集增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的细胞裂解液,分别加入泛素化混合物于37℃孵育1 h、2 h、6 h,采用蛋白质印记法检测2组细胞中Smad7的体外降解水平;④收集增生性瘢痕成纤维细胞的细胞裂解液,同时加入泛素化混合物及蛋白酶体抑制剂MG132/MG115(50μmol/L∶50μmol/L),研究其对Smad7体外降解的抑制作用;⑤利用免疫共沉淀技术,检测增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7与E3泛素连接酶Smurf2是否存在相互作用;⑥采用siRNA干扰技术沉默增生性瘢痕成纤维细胞中Smurf2的基因表达,研究沉默Smurf2后,增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7蛋白在TGF-β1刺激下的表达水平。实验数据采用两样本t检验、单因素方差分析进行统计分析,组内两两比较采用SNK法,以P<0.05认为差异有统计学意义。结果在正常皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞中,Smad7的蛋白表达水平无明显差异(t=0.763,P=0.46);②在外源性TGF-β1刺激下,正常皮肤成纤维细胞中Smad7 mRNA和蛋白表达水平均呈时间依赖性增高均P<0.05,增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7 mRNA表达呈时间依赖性增加(除5 min时P>0.05,其余各时间点与未刺激细胞比较,P值均<0.05),蛋白水平无明显变化(P>0.05);③正常皮肤成纤维细胞中,Smad7的体外降解无明显变化(P=0.162),增生性瘢痕成纤维细胞中,Smad7的体外降解增强(各时间点Smad7蛋白表达水平与对照组及上一个时间点比较,除2 h与1 h比较时P值为0.012,其余P值均为0.000);④蛋白酶体抑制剂MG132/MG115可以阻断增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7的体外降解;⑤在用Smurf2抗体免疫共沉淀下来的蛋白复合物中检测到Smad7,表明增生性瘢痕成纤维细胞中Smurf2与Smad7存在相互作用;⑥增生性瘢痕成纤维细胞中,加入TGF-β1刺激,Smad7的蛋白表达水平无明显变化;沉默Smurf2基因后,Smad7蛋白在TGF-β1刺激下表达增高。结论在烧伤后儿童增生性瘢痕成纤维细胞中,Smurf2通过泛素化降解Smad7,削弱了Smad7对TGF-β1信号转导的抑制作用,从而增强了TGF-β1/Smad信号转导,可能参与了增生性瘢痕的形成。
