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摘要
目的:研究可溶性细菌氧化还原蛋白AZURIN对人骨肉瘤U2OS细胞的生长抑制效应及凋亡诱导作用。方法:用PCR方法由假单胞菌染色体DNA扩增AZURIN基因片段,将其融合插入原核表达载体pQE30中,并在M15大肠杆菌表达可溶性的AZURIN蛋白。该蛋白经纯化和复性后,诱导人骨肉瘤U2OS细胞,通过MTT法、Hoechest33258荧光染色法及倒置显微镜观察凋亡细胞;流式细胞仪分析细胞周期、凋亡率、线粒体膜电位变化和DNA断裂实验检测细胞增殖和细胞凋亡。结果:AZURIN的蛋白纯度达99.1%以上。用50~200mg/L的蛋白诱导人骨肉瘤U2OS细胞12h以上细胞的生长和增殖被显著抑制,并且观察到典型的凋亡细胞、凋亡小体、凋亡峰及DNA的片段化等凋亡的特征性变化,线粒体跨膜电位随着AZURIN作用的时间和浓度的增加而逐渐降低,对照组和50mg/LAZURIN、100mg/LAZURIN、200mg/LAZURIN组细胞线粒体跨膜电位分别降低(7.76±0.47)%、(9.01±0.87)%、(24.13±2.12)%、(37.48±3.59)%(P<0.01)。细胞的凋亡率也呈剂量依赖和时间依赖关系,作用48h时凋亡率达峰值(35.8±3.78)%。结论:利用大肠杆菌制备的小分子蛋白AZURIN对人骨肉瘤U2OS细胞有明显的增殖抑制效应和凋亡诱导作用,线粒体途径可能是AZURIN诱导细胞凋亡的机制之一。
- 出版日期2005
- 单位浙江大学医学院附属第二医院
