CRISPR/Cas9系统靶向沉默Fas基因在肝衰竭细胞凋亡机制中的作用

作者：庄鹏; 李志莹; 罗敏虹

来源：热带医学杂志, 2019, 19(04): 434-437.

• CRISPR/Cas9
• Fas
• 凋亡
• 肝衰竭

目的探讨利用CRISPR/Cas9敲除系统沉默Fas基因介导的细胞凋亡在肝衰竭发生机制的作用。方法构建靶向Fas基因的CRISPR/Cas系统(pX330-Fas-G1)质粒并转染HepG2细胞(设非转染细胞HepG2为对照组),提取DNA后T7E1酶切法检测突变体;Western blotting检测Fas蛋白的表达。刀豆素A药物处理后MTT法检测细胞增殖,克隆增生法检测细胞增生,AnnexinV/PI荧光双染分析细胞凋亡情况。结果 T7E1酶切分析显示,pX330-Fas-G1质粒的Guide RNA在Fas基因组上产生了有效切割,切割效率为50%;同时Western blotting检测结果显示,pX330-Fas-G1质粒转染至HepG2细胞后,与空白质粒pX330-GFP组比较,Fas蛋白的表达降低,差异有统计学意义(P<0.01)。经刀豆素A药物诱导细胞凋亡后,MTT法测定pX330-Fas-G1质粒转染的HepG2细胞组活力值为(68.0±5.0)%,高于非转染细胞组的(51.5±5.8)%,差异有统计学意义(P<0.05);克隆增生法检测结果显示,pX330-Fas-G1质粒转染的HepG2细胞组在细胞克隆形成数量为(128.8±5.1),高于非转染组的(100.0±9.3),差异有统计学意义(P<0.05)。给予刀豆素A药物处理诱导细胞凋亡后,通过Annexin V和PI双染色,采用流式细胞技术检测显示,经pX330-Fas-G1质粒转染后的细胞组有10.0%的细胞为凋亡细胞,低于对照组细胞的33.3%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 CRISPR/Cas9系统可通过下调Fas基因的表达来抑制细胞凋亡的进展,为临床开展急性肝衰竭的基因治疗提供理论依据和技术支持。

• 出版日期2019
• 单位深圳市第六人民医院; 中山大学附属第八医院