苹果属垂丝海棠MhPPOX1基因克隆及抗缺铁性功能鉴定

摘要

原卟啉原氧化酶(Protoporphyrinogen oxidase, PPOX1)是叶绿素生物合成途径中的关键酶,为深入探究苹果PPOX1基因的功能,该研究以苹果砧木垂丝海棠(Malus halliana)为试材,采用PCR方法,克隆MhPPOX1基因,并进行生物信息学分析及功能鉴定;采用农杆菌介导法转化烟草和拟南芥,进一步分析MhPPOX1在缺铁胁迫中的功能,并对转基因烟草与拟南芥进行抗性分析。结果表明:(1)成功克隆获得垂丝海棠MhPPOX1基因片段,经序列比对鉴定为苹果的MhPPOX1基因(序列号:LOC103444480)。MhPPOX1基因的开放阅读框为1 644 bp,编码547个氨基酸,等电点为8.98;系统进化树分析表明,苹果属垂丝海棠MhPPOX1与白梨该家族蛋白的亲缘关系最近。(2)成功克隆获得垂丝海棠MhPPOX1启动子序列片段(2 016 bp),对该启动子顺式作用元件预测结果显示,MhPPOX1启动子序列中存在干旱、低温、光、生长素以及与叶绿素相关等响应元件。(3)成功构建过表达载体MhPPOX1-pRI101,并成功获得转MhPPOX1基因烟草和拟南芥。(4)qRT-PCR分析表明,垂丝海棠幼苗在缺铁(-Fe)胁迫下植株叶片黄化枯死,且MhPPOX1基因表达量较对照显著升高;转MhPPOX1基因烟草和拟南芥在缺铁胁迫中与野生型相比均生长良好,不易黄化,且缺铁条件下转基因拟南芥和烟草的叶绿素a、叶绿素b总量以及总铁含量明显高于野生型植株,表明MhPPOX1基因过量表达提高了拟南芥和烟草对缺铁胁迫的抗性。研究认为,MhPPOX1基因在植物抵抗缺铁胁迫中可能发挥重要作用。

关键词