AGEs-RAGE通路在盆底器官脱垂疾病中的研究

作者：陈义松

来源：博士, 复旦大学, 2014.

• 盆底器官脱垂
• Ⅰ型胶原纤维
• 晚期糖化终末产物
• 晚期糖化终末产物受体
• 基质金属蛋白酶
• p38
• p65
• SD大鼠
• 电镜

盆底器官脱垂性疾病(POP)是中老年妇女常见的疾病,严重影响了其生活质量,然而,其发病机制尚不明确。因此有关其发病机制的研究一直是妇产科研究学者关注的焦点和亟待解决的难题。作为盆底支持结构的主要成分,盆底结缔组织的病理生理变化与POP的发生发展密切相关。盆底结缔组织主要由成纤维细胞为主的细胞成分和胶原纤维为主的细胞基质成分组成。在正常人体结缔组织中,由成纤维细胞调节胶原纤维的合成、降解,二者达到动态平衡。然而当此平衡被打破,胶原纤维在重塑过程中发生结构和功能的异常,而发生了相应的病理生理变化,如盆底器官的脱垂。近年来研究发现,糖化终末产物(Advanced Glycated End-products, AGEs)和其受体(Receptor of AGEs, RAGE)结合后,启动细胞内多种信号传导途径,参与纤维细胞的增殖、凋亡和胶原的合成、分解代谢,进而调节及原纤维的重塑。它广泛地涉及到了多种系统和组织的病理生理变化,比如皮肤老化、心血管损伤和重构、糖尿病肾脏疾病、骨骼重构、牙龈增生、疤痕增生等。在皮肤中,AGEs与RAGE结合后,可通过ROS、NO、神经酰胺、P38、JNK-MAP激酶等信号机制的活化促进成纤维细胞的凋亡。重要的是AGEs与RAGE结合后可通过上述信号传导机制激活NF-K B (nuclear factor-k-gene binding)影响成纤维细胞合成和分泌胶原纤维。同时AGEs结合RAGE后还能影响细胞基质的降解,如促进MMP-1和TIMP-1的合成和分泌。1996年Jackson设想：由于盆底结缔组织AGEs的增加,一方面使得盆底胶原纤维容易断裂,盆底结缔缺乏应有的生物力学性能;另一方面,AGEs的增加妨碍了盆底胶原纤维的代谢平衡,新生胶原无法成功塑形并发挥应有的力学性能,从而导致了盆底功能障碍的发生。上述理论似乎合理地解释了盆底功能障碍性疾病的发病机制,但尚缺乏足够的证据。因此,为了进一步AGEs-RAGE与盆底器官脱垂之间的关系,本研究项目设计并完成了以下的实验。第一部分AGEs、RAGE和Collagen Ⅰ在盆底器官脱垂疾病阴道壁的表达[研究目的]研究AGEs、RAGE和collagen Ⅰ在盆底器官脱垂性疾病阴道壁的表达及其与POP的关系。[研究对象和方法]我院2012年因盆底器官脱垂POP-Q评分Ⅲ度及以上需行全子宫切除术者为研究组,共44例；因其他疾病需行全子宫切除术者为对照组,共46例。采用免疫组化和Western Blooting的方法,检测研究组和对照组阴道壁穹窿部位AGEs、RAGE 和 Collagen Ⅰ的表达,采用RAGE全基因测序的方法检测24例研究组和25例对照组RAGE全基因序列,寻找存在临床意义SNP位点。[研究结果]盆底器官脱垂组阴道壁内collagen Ⅰ含量低于对照组,且随着年龄的增加其含量也下降(P<0.05);盆底器官脱垂性疾病阴道壁内AGEs含量高于对照组(p<0.05)；盆底器官脱垂性疾病阴道壁组织内RAGE的含量与对照组无统计学差异(P>0.05)；RAGE全基因测序后发现两个潜在的SNP(Single Nucleotide Polymorphism)位点,但均位于内含子,且与外显子相距较远,在剪接的过程中被丢弃的可能很大,因此存在有临床意义的SNP位点的可能性较低。[结论]研究显示AGEs的提高和collagen Ⅰ的下降与POP的发生存在相互对应关系,提示AGEs量的改变与盆底器官的脱垂存在相关性。第二部分AGEs-RAGE通路在盆底成纤维细胞Ⅰ型胶原代谢中的作用[研究目的]研究AGEs-RAGE通路在盆底成纤维细胞Ⅰ型胶原代谢中的作用[研究对象和方法]取研究组和对照组阴道壁组织各3例,进行成纤维细胞的原代培养、鉴定,采用SRB的方法检测AGEs对成纤维细胞的促进凋亡的作用,再用WB 和 real time PCR的方法检测AGEs对成纤维细胞分泌collagen Ⅰ、MMP-1、 TIMP-1、RAG E的蛋白和合成]nRNA的影响。[研究结果]盆底器官脱垂组成纤维细胞在AGEs的作用下更容易出现调亡(25mmg/L),对照组则需要AGEs增加到一定的浓度才出现凋亡(75mg/L)。盆底器官脱垂组成纤维细胞合成分泌较原纤维下降(p<0.05),合成和分泌MMP-1上升(p<0.05)；在mRNA水平,TIMP-mRNA随着AGEs的增加出现下降,RAGE出现缓慢上升而后下降,但其蛋白的分泌和和合成无显著变化；而对照组在接受不同浓度的AGEs作用后,其collagenⅠ下降和MMP-1上升幅度不如盆底脱垂组细胞明显,或没有变化,TIMP-1和RAGE也无变化。[研究结论]结果提示AGEs容易使盆底器官脱垂患者的成纤维细胞出现凋亡,更容易使collagen Ⅰ表达下降,MMP-1表达上升。第三部分AGEs-RAGE通路在POP成纤维细胞胶原代谢中的信号机制的研究[研究目的]AGEs-RAGE通路在POP成纤维细胞胶原代谢中的信号机制的研究。[研究方法和步骤]采用WB的方法检测AGEs作用盆底脱垂组成纤维细胞的RAGE、MAPK-p38、NF-kB-p65信号通路的变化。分别采用SiRN、SB203580、 PDTC阻断RAGE、MAPK-p38、NF-kB-p65信号分子。最后用real time PCR的方法验证。[研究结果]首先经过筛选发现,P-p38在加药后16分钟出现高峰,P-p65在加药后1小时出现高峰。然后选用自行设计的SiR NA将RAGE阻断,Sb203580阻断MAPK, PDTC阻断NF-kB。研究发现,阻断RAGE后,其下游的P38,NF-kB被阻断,下游的作用产物如collagen Ⅰ 和 Mmp-1也被阻断；仅仅阻断P38 不能阻断NF-kB及其下游的产物,阻断NF-kB分子能影响其下游的产物的合成。最后利用real time PCR从mRNA水平间各个阻断节点,结果与免疫印迹结果相对应。[结论]AGEs与RAGE结合后,通过激活P-p38、P-p65,引起胶原纤维合成和分泌的下降、MMp-1合成和分泌的上升,可造成结缔组织胶原纤维含量的下降,但MAPK-P38并非是此水平的唯一信号分子。第四部分AGEs-RAGE通路在SD大鼠腹壁缺损修复过程中的变化[研究目的]研究AGEs-RAGE通路在SD大鼠腹壁缺损修复过程中的变化和作用,研究AGEs-RAGE通路与collagen Ⅰ重塑以及缺损修复效果的关系。[研究方法和步骤]刚成年的SD大鼠人造腹壁缺损,然后利用三种不同的方法进行缺损修补,即聚丙烯网片、SIS生物合成网片、双侧腹直肌直接对缝。然后在术后3、9、15、21个月观察缺损修复的情况,包括修复部位宏观观察、电镜超微结构的观察、修复部位力学性能的检测,最后检测修复部位collagen Ⅰ、AGEs、 RAGE表达的变化和区别。分析AGEs-RAGE通路与collagen Ⅰ和修复效果之间的相互关系。[研究结果] SIS生物合成网片组仿真度好、柔软,但出现膨出较其他组增多(p<0.05)；力学性能检测其修复部位最大抗张力最低(p<0.05)；电镜下发现胶原纤维增生较慢、稀疏,成纤维细胞、局部血管增生管径较小；而且检测到修复部位collagen Ⅰ含量最低、AGEs含量最高(p<0.05),而RAGE的表达无明显差异(p>0.05)。AGEs在术后先出现上升,而后出现下降;collagen Ⅰ含量在术后早期各组基本相似,但在术后中远期SIS网片植入组collagen Ⅰ含量最低。[结论]术后早期SIS网片的降解是缺损部位膨出的直接原因,中晚期胶原代谢异常促进了局部膨出；AGEs抑制了局部胶原纤维代谢的合成,加速了胶原纤维的降解促进了局部膨出；而且在术后15月以后AGEs已基本降低到正常范围,但其妨碍胶原代谢的作用后果已造成。全文结果根据前述各部分结果可知：1, AGEs-RAGE通路参与并抑制了盆底器官脱垂患者阴道壁胶原纤维合成,加速其降解过程；2, AGE-RAGE通路通过激活MAPK. NF-kB信号分子发挥作用,影响了盆底结缔组织较远代谢,但这并不是唯一的信号途径；3, AGEs发挥作用多在损伤修复早期,并妨碍修复的顺利进行,数月后可能开始降至正常范围。本研究为盆底器官的脱垂提供了理论依据,即AGE-RAGE通路通过抑制胶原纤维合成、促进胶原纤维的降解,进一步促进了POP的发生；也为盆底器官脱垂的治疗奠定了理论基础。

• 出版日期2014
• 单位复旦大学