高内涵筛选技术联合多能性基因Oct4、Sox2和Nanog检测建立药物胚胎毒性快速筛查方法

作者：鲁娣; 宋殿荣^*; 张崴; 郭洁; 王雅楠; 杜文欣

来源：药物评价研究, 2022, 45(09): 1786-1794.

• 胚胎毒性
• 高内涵
• 多能性基因
• 方法建立
• 增殖毒性

目的 通过高内涵筛选技术评价测试药对PA-1细胞的增殖毒性，并联合分化毒性的评价指标——多能性基因(Oct4、Sox2和Nanog)表达检测，初步建立药物胚胎毒性快速筛查方法。方法 选择维生素C、青霉素G、维生素E作为无胚胎毒性的阴性测试药，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺作为具有胚胎毒性的阳性测试药。以测试药临床治疗剂量下的最大血药浓度(Cmax)为基础设置加药浓度，阴性测试药设置浓度梯度为：1/2Cmax、Cmax、2Cmax、3Cmax、4Cmax；阳性测试药设置浓度梯度为：1/8Cmax、1/4Cmax、1/2Cmax、Cmax、2Cmax。测试药物在维持培养液(培养液加入1×106U·L-1的白血病抑制因子)中作用于PA-1细胞24 h后，基于高内涵筛选技术，应用DAPI、Calcein-AM、PI共染PA-1细胞，通过共聚焦成像检测荧光强度，计算细胞存活率；测试药物在分化培养液(不加入白血病抑制因子)中作用于PA-1细胞24 h后，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的表达变化。结果 DAPI、Calcein-AM、PI 3者共染可以很好地区分活细胞及死细胞；阴性测试药维生素C、维生素E、青霉素G对PA-1细胞的增殖能力均无影响；与对照组比较，阳性测试药5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤1/4Cmax及以上浓度引起PA-1细胞存活率显著下降(P<0.05)；环磷酰胺1/8Cmax及以上浓度引起PA-1细胞存活率显著下降(P<0.05)。阴性测试药维生素C、维生素E、青霉素G对PA-1细胞多能性基因Sox2、Oct4、Nanog的表达均无影响。与对照组比较，阳性测试药5-氟尿嘧啶1/8Cmax及以上浓度使PA-1细胞多能性基因Sox2、Oct4、Nanog的表达显著下降(P<0.05)；甲氨蝶呤1/8Cmax及以上浓度使Oct4、Nanog的表达显著增加(P<0.05)，但当浓度达到2Cmax时对Sox2的表达依然没有影响；环磷酰胺1/8Cmax及以上浓度使Sox2、Oct4、Nanog的表达均显著增加(P<0.05)。结论 高内涵筛选技术(DAPI、Calcein-AM、PI共染)联合多能性基因的检测可初步建立药物胚胎毒性快速筛查方法。

• 出版日期2022
• 单位天津中医药大学第二附属医院