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摘要
为表达和纯化尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)cyp19a1a蛋白,本研究从尼罗罗非鱼卵巢提取总RNA,反转录获得cDNA模板后,利用设计的引物PCR扩增cyp19a1a ORF区1200 bp片段,双酶切后连接到pET-28a(+)表达载体上,经酶切验证和DNA测序鉴定,证明成功构建了pET-28a-cyp19a1a原核表达载体。将表达载体转化到大肠杆菌(E.coli)BL21中,优化IPTG诱导浓度和诱导时间。结果显示,在0.5 mmol/L IPTG诱导8 h后,cyp19a1a重组蛋白大量表达,并以包涵体形式存在。通过Ni2+-NTA层析柱和切胶纯化,获得与预期片段大小一致的表达蛋白,并用Western blotting验证了纯化的蛋白为目的蛋白。本研究为制备cyp19a1a抗体和研究高温对cyp19a1a蛋白表达的影响提供了重要的基础。
