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摘要
目的构建轮状病毒外膜蛋白VP4、VP7基因与大肠杆菌LTB蛋白基因的重组表达载体,研究重组表达蛋白的免疫原性,为研制犊牛腹泻基因工程亚单位疫苗奠定基础。方法克隆A组牛轮状病毒临床分离株CHLY的VP4、VP7基因和大肠杆菌LTB基因,插入pET32a中构建了4个原核表达载体pET32a/VP7、pET32a/VP4、pET32a/VP7-LTB、pET32a/VP4-LTB,转化到BL21(DE3)中进行表达纯化,纯化蛋白与弗氏佐剂混合免疫10 w龄雌鼠,在实验期间对雌鼠进行交配,对其所产乳鼠用150μL10-6.5/0.1 mL TCID50的轮状病毒进行攻毒以研究重组蛋白免疫原性和攻毒保护性。结果重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式存在,Bandscan扫描分析结果显示,它们分别占菌体总蛋白的35%、20%、30%、18%,利用Ni-NTA Agarose在变性条件下成功纯化得到高纯度重组蛋白。10 w龄雌鼠免疫试验表明rVP4-LTB组激发了最强的免疫反应,rVP4组次之,rVP7-LTB组略高于rVP7,各个免疫组间的差异性不显著(P>0.05),各实验组IgG抗体水平显著高于空质粒对照组(P<0.01)。雌鼠所产乳鼠的攻毒实验表明,免疫组雌鼠所产乳鼠腹泻率为13.35%～23.8%,腹泻持续时间为48h～72h,较空质粒对照组明显降低,腹泻症状较轻且症状持续时间明显缩短。四个重组蛋白组攻毒保护率为76.2%～86.7%,rVP7-LTBr、VP4-LTB两组略高于rVP7r、VP4组,但相互间差异不显著(P>0.05)。结论重组蛋白具有较好的免疫原性,被免疫雌鼠体内产生的中和性抗体可以经被动免疫过程传递至子代,并为仔鼠提供保护。本研究为犊牛轮状病毒基因工程疫苗的研究奠定了一定的基础。
