柯萨奇病毒A组6型通用抗原检测试剂盒的建立

作者：刘思远; 卞莲莲; 高帆; 刘佩; 霍雅倩; 王泽鋆; 张中洋; 李雅静; 戈小琴; 顾美荣; 安超强; 李克雷; 毛群颖^*; 姜崴^*

来源：中国生物制品学杂志, 2021, 34(03): 300-306.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003292

• 柯萨奇病毒A组6型
• 抗原
• 试剂盒
• 酶联免疫法
• 中和试验

目的建立柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)疫苗抗原定量检测试剂盒,用于CV-A6疫苗以及含有CV-A6的手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)多价疫苗的研发及质量控制。方法分别采用多个CV-A6毒株与多家企业的CV-A6抗原,通过结合能力和中和能力比较,从6个单克隆抗体(9H1、3D9、10F4、5A6、6D12和10G8)中筛选出具有广谱高结合能力及高中和能力的单克隆抗体,建立ELISA法CV-A6抗原定量检测试剂盒。对试剂盒进行线性、专属性、准确度、精密度、耐用性等验证。将试剂盒分发国内主要CV-A6疫苗研发企业,由各企业分别采用该试剂盒对各自制备的CV-A6疫苗原液以及生产工艺各中间环节制品进行CV-A6抗原含量检测,考核试剂盒适用性。结果以多克隆抗体CV-A6-3I作为包被抗体,最佳浓度为1∶8 000,以5A6单克隆抗体作为酶标抗体,最佳浓度为1∶8 000;包被条件为4℃过夜;封闭液为10%FBS+PBST+5%蔗糖,37℃封闭2 h;抗体稀释液为ED-33,酶标抗体作用条件为37℃1 h;显色条件为37℃10 min。建立的CV-A6抗原检测试剂盒线性范围为11～178 ng/mL,线性良好,定量检出限为11 ng/mL;与同为小RNA病毒科的CV-A16、甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)、CV-A10、EV-A71以及MEM、DMEM和PBS缓冲液等均无交叉反应,专属性良好;检测回收率在83%～114%之间,单个实验员和2个实验员重复检测CV均小于15%,准确度、重复性和中间精密度均良好;抗原或酶标抗体孵育时间上下浮动5 min或反应温度上下浮动2℃,回收率在83%～107%之间,耐用性良好。该试剂盒检测4个企业制备的CV-A6疫苗原液和疫苗制备过程中的中间制品均具有良好的线性和平行性,提示该试剂盒对国内主要CVA6疫苗及中间制品均具有良好的适用性。结论本研究采用具有高效价、广谱中和活性的单克隆抗体和多克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA法CV-A6疫苗抗原定量检测试剂盒。经方法验证和适用性研究,证明该试剂盒各项指标良好,可作为CV-A6疫苗通用试剂盒用于CV-A6抗原含量检测,为CV-A6疫苗和HFMD多价疫苗研发及质量控制提供了可靠的检测手段。

• 出版日期2021
• 单位北京科兴生物制品有限公司; 中国食品药品检定研究院; 武汉生物制品研究所有限责任公司; 长春生物制品研究所; 北京民海生物科技有限公司