一种改进后的重叠延伸PCR法对被孢霉重组载体的构建

作者：孟祥亮; 王宁新; 牛丽华; 李培光; 李洋; 黄大卫

来源：生物技术通报, 2013, (09): 62-67.

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2013.09.024

• 逐次退火
• 重叠区域PCR
• 突变
• 拼接 Successive anneal Overlap extension PCR Mutagenesis Splice

为了提高DNA大片段的拼接效率,通过引入逐次退火的PCR的方法,改良了传统的重叠延伸PCR方法。逐次退火PCR法,一方面延长了重叠区的PCR引物长度;另一方面把原来在1个循环中1个退火温度改成若干个,逐次降低退火温度,适用于Tm值相差比较大的引物;相邻的退火温度之间相差3-6℃。结果显示,通过此种方法成功拼接了ω3(2)和HCT两个大片段;PCR产物电泳条带单一,克隆测序证实序列完全正确,可以直接应用于后续试验。这种改进后的方法可以有效减少非特异性扩增,提高灵敏度,把这种方法称之为逐次退火重叠延伸PCR。

• 出版日期2013
• 单位中国科学院动物研究所; 山东农业大学