基于猪流行性腹泻病毒变异毒株重组全长S2蛋白IgA抗体ELISA检测方法的建立及应用

作者：牟一娇; 于瑞明; 张莉萍; 王永录^*

来源：中国畜牧兽医, 2023, 50(03): 1185-1194.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.03.033

• 猪流行性腹泻
• S2蛋白
• IgA抗体
• ELISA

【目的】建立一种猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的IgA抗体ELISA检测方法。【方法】以PEDV流行株CH/HNPJ/2017(MF152604.1)为生物材料，通过RT-PCR扩增出S2基因(2 368—4 170 bp),并将其插入到原核表达载体pET-24a中，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，利用IPTG诱导表达，经镍柱纯化。Western blotting验证重组蛋白S2与PEDV阳性血清的反应原性和特异性。将其作为包被抗原，建立一种基于PEDV变异毒株重组全长S2蛋白的IgA抗体ELISA方法，用棋盘法确定该方法的最优检测条件，对其敏感性、特异性和重复性进行测定，并初步应用于130份猪血清和40份猪口腔黏液的检测。【结果】通过RT-PCR方法扩增出S2基因，成功构建重组表达载体pET-24a-S2,转化大肠杆菌经诱导表达纯化后获得重组S2蛋白。SDS-PAGE结果显示，纯化的S2蛋白条带特异且无杂带；Western blotting试验表明该蛋白与PEDV阳性猪血清具有良好的反应性。ELISA方法反应条件优化结果显示，重组S2蛋白的最佳包被条件为每孔0.5μg、4℃过夜包被；血清最佳反应条件为1∶160稀释，37℃孵育60 min;酶标二抗最佳反应条件为1∶5 000稀释，37℃反应30 min; TMB最佳显色时间为室温下10 min。待检样品S/P值≥0.04时为阳性，S/P值≤0.02时为阴性，S/P值介于0.02～0.04之间为可疑。利用本试验建立的ELISA方法检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪德尔塔冠状病毒标准阳性血清，S/P值均<0.02,显示为阴性，说明该方法具有良好的特异性；将PEDV阳性血清进行640倍稀释时利用该方法检测仍为阳性，说明该方法具有良好的敏感性；利用该方法进行批间批内试验，变异系数均小于8%(在10%以内),表明该方法具有良好的重复性。利用该方法检测保存的130份猪血清，结果与IDEXX IgA抗体检测试剂盒的符合率为90.77%;该方法对40份猪口腔黏液的检测结果表明，阳性检出率为90.0%,阴性检出率为为93.3%。【结论】本研究成功构建pET-24a-S2重组质粒，获得纯度较高的重组S2蛋白，并以此作为包被蛋白建立了基于全长S2蛋白IgA抗体ELISA检测方法。该方法能同时有效检测血清和口腔黏液样本，且敏感性强、特异性高、稳定、重复性好，该方法对PEDV的临床诊断及防控具有重要临床实践意义。

• 出版日期2023
• 单位中农威特生物科技股份有限公司; 中国农业科学院兰州兽医研究所