大肠杆菌表达的重组新蛭素的生产工艺

作者：吴祖泽; 郭莹莹; 刘玉斌; 郭彦梅; 董俏言; 靳继德; 姚敏; 于爱平

来源：北京工业大学学报, 2016, 42(02): 302-308.

• 新蛭素
• 大肠杆菌
• 高密度发酵
• 离子交换层析
• 抗凝活性

为建立可产业化的大肠杆菌表达的重组新蛭素(neorudin,EH)生产工艺,主要采取从低密度到高密度发酵的优化思路,优化了发酵罐培养基和诱导时间;比较了超声破碎和反复冻融的目的蛋白提取方法;纯化工艺采用离子交换层析2步法进行:SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和Source 15Q阴离子交换层析;所得产品用免疫印迹法鉴定,经HPLC检测纯度,凝块法检测抗凝比活性;最后对纯化产品进行结构确证,包括高分辨率质谱、C-末端测序、N-末端测序、二硫键分析.结果显示:优化后的发酵工艺确定基于TB培养基的高密度发酵工艺,菌体OD600可达40左右,每升菌体湿质量可达70 g左右,目的蛋白表达量约400 mg/L;菌体反复冻融离心上清经过纯化获得的目的蛋白HPLC纯度均大于97%,纯化收率为26.12%,抗凝比活性为1 024 ATU/mg,用高分辨率质谱检测其分子质量约为7 415.188 0 ku,N-末端、C-末端和二硫键均与理论相符.建立了EH在大肠杆菌中的高密度发酵和纯化工艺.

• 出版日期2016
• 单位生物工程学院; 军事医学科学院放射与辐射医学研究所; 北京工业大学