敲除RIG-I基因流感病毒高产MDCK细胞系的建立及功能研究

作者：曾为俊; 许曼; 王辉; 鲁国涛; 邵玉乐; 陈洪岩; 刘建华^*; 孟庆文^*

来源：中国家禽, 2019, 41(11): 12-17.

DOI：10.16372/j.issn.1004-6364.2019.11.003

• RIG-I
• CRISPR/Cas9
• MDCK细胞系
• 基因敲除
• H9N2亚型流感病毒

利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID50。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的MDCK细胞(MDCK-RIG-I-/-),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后MDCK-RIG-I-/-的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID50测定结果显示,差异最高可分别达到野生型MDCK的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒MDCK细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。

• 出版日期2019
• 单位中国农业科学院哈尔滨兽医研究所; 兽医生物技术国家重点实验室; 新疆农业大学