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摘要
目的:建立并验证rAAV2-ND4中可复制型AAV2(rcAAV2)的qPCR检测方法。方法:rAAV2-ND4样品(3.0×1010 vg·mL-1,每孔接种100μL)和wtAd5辅毒(6.0×109 TCID50·mL-1,每孔接种10μL)同时感染HEK293细胞(6.0×105 cells·mL-1,每孔1 mL接种至12孔板中，37℃和5%二氧化碳条件培养24 h),经过2 h感染后，更换为细胞培养基(含10%FBS的DMEM,每孔加入1 mL),继续在37℃和5%二氧化碳条件培养48 h。收集细胞并用细胞裂解液处理，细胞裂解物再经上述步骤进行1次感染和培养。收集第二次培养的细胞并加入裂解液56℃孵育30 min,之后90℃孵育10 min。处理后的细胞裂解物用qPCR方法进行rcAAV2检测，qPCR反应体系为2×T5 Fast qPCR Mix(Probe) 10μL、引物混合液0.1μL、探针1μL、50×ROX Reference Dye I 0.4μL、EASY Dilution 3.5μL、处理后的细胞裂解物5μL,qPCR扩增程序：95℃,10 min;[95℃,15 s; 60℃,1 min]40个循环。对方法进行灵敏度、准确度、精密度和专属性验证。结果:所建立的检测rcAAV2的方法灵敏度可达到每108 vg<1 TCID50 rcAAV;qPCR方法回收率在77.6%～91.2%;每人3次(2人)实验均得到相同结果，方法专属性良好。结论:所建立的2轮感染扩增后qPCR检测的方法可应用于rAAV2-ND4样品中rcAAV2的检测。
- 出版日期2023
- 单位中国食品药品检定研究院
