科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的构建大鼠CREB结合蛋白(CREB binding protein,CBP)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并观察该载体对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)CBP表达的沉默效应。方法设计合成4条CBP基因的siRNA序列,将筛选确定的CBP RNAi有效靶序列与pFU-GW-iRNA载体连接产生CBP shRNA慢病毒表达载体,转化、PCR筛选阳性克隆及测序鉴定。脂质体2000将CBP shRNA慢病毒载体和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,完成慢病毒颗粒包装及滴度测定。包装产生的重组慢病毒感染大鼠VSMCs,实时定量RT-PCR检测CBP mRNA的表达,并与未转染及转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞进行比较。结果 PCR扩增和测序结果证实,成功构建大鼠CBP shRNA慢病毒载体。经包装产生的慢病毒滴度为2×10~9 TU/ml,与未转染慢病毒及转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞比较,CBP shRNA慢病毒转染可使VSMCs的CBP mRNA分别下降88.5%和92.7%。结论成功构建CBP基因RNAi慢病毒表达载体,对VSMCs的CBP表达具有良好沉默作用,为后期基因治疗血管增殖性疾病奠定基础。
- 出版日期2010
- 单位武汉大学; 武汉大学人民医院
