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摘要
目的 探讨哺乳动物细胞表达载体启动子上增强子和CpG岛调控元件在转基因沉默和位置效应中的作用。方法 应用带增强子的八聚体结合转录因子4(OCT4)基因启动子、带CpG岛的性别决定区Y框蛋白2(SOX2)基因启动子、带增强子和CpG岛的巨细胞病毒(CMV)基因启动子以及不含近端增强子和CpG岛的NANOG基因启动子构建哺乳动物细胞表达载体，并分别转染中国仓鼠卵巢细胞株CHO-K1细胞和人胚胎肾细胞(HEK293)。应用Image J软件中Mean算法计算OCT4、SOX2、CMV和NANOG基因启动子在CHO-K1细胞和HEK293细胞介导的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达的荧光强度，应用Image J软件中Mininum、Maxentropy、Mean 3种算法分别计算OCT4、SOX2、CMV和NANOG基因启动子4种载体稳定转染CHO-K1细胞后形成的多个单细胞克隆混合生长样品在同一个样本中最大荧光强度的细胞、大于平均荧光强度的所有细胞和最小荧光强度的所有细胞的EGFP平均荧光强度；应用有限稀释法从G418筛选后获得的稳定转染的多个单克隆混合的CHO-K1细胞中，分别筛选含EGFP的pE-C1、pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog质粒稳定转染CHO-K1细胞的单克隆细胞，每个质粒载体随机筛选3个单克隆细胞，应用Image J软件分析EGFP平均荧光强度；应用酶联免疫吸附法检测转染第20、30天CHO-K1细胞中EGFP蛋白表达水平，应用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测转染第20、30天CHO-K1细胞中EGFP mRNA表达水平。结果 SOX2基因启动子在CHO-K1细胞和HEK293细胞中介导表达的EGFP平均荧光强度比较差异无统计学意义(t=0.770,P>0.05)。OCT4、CMV、NANOG基因启动子在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP平均荧光强度显著高于HEK293细胞(t=7.000、11.100、4.900,P<0.05)。SOX2基因启动子于转染第20、30天在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP蛋白水平比较差异无统计学意义(t=0.330,P>0.05)。CMV基因启动子于转染第20天在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP蛋白水平显著低于转染第30天(t=3.770,P<0.05);OCT4基因启动子于转染第20、30天在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP蛋白水平比较差异无统计学意义(t=2.500,P>0.05);NANOG基因启动子于转染第20、30天在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP蛋白表达水平比较差异无统计学意义(t=0.014,P>0.05)。转染第20天与转染第30天SOX2、CMV、NANOG基因启动子在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP平均荧光强度值比较差异均无统计学意义(t=0.130、0.830、0.210,P>0.05);转染第30天，OCT4基因启动子在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP平均荧光强度值显著低于转染第20天(t=5.750,P<0.05)。SOX2、CMV、OCT4、NANOG基因启动子在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP蛋白水平比较差异无统计学意义(F=4.070,P>0.05)。CMV、OCT4、NANOG基因启动子在CHO-K1细胞中介导的EGFP mRNA相对表达量显著高于SOX2基因启动子(t=5.440、5.000、5.740,P<0.05);CMV、OCT4基因启动子在CHO-K1细胞中介导的EGFP mRNA相对表达量显著高于NANOG基因启动子(t=3.220、4.270,P<0.05);CMV基因启动子在CHO-K1细胞中介导的EGFP mRNA相对表达量高于OCT4基因启动子，但差异无统计学意义(t=1.270,P>0.05)。SOX2基因启动子介导表达的EGFP在转录水平和转录后水平差异最大(t=16.900,P<0.05);NANOG基因启动子介导表达的EGFP在转录水平和转录后水平差异次之(t=14.930,P<0.05);OCT4和CMV基因启动子介导表达的EGFP在转录水平和转录后水平差异最小(t=2.060、0.430,P>0.05)。应用Mininum、Maxentropy、Mean 3种算法计算OCT4基因启动子在多克隆下介导表达的EGFP的荧光强度比较差异无统计学意义(F=3.720,P>0.05),SOX2、CMV和NANOG基因启动子在多克隆下介导EGFP表达的荧光强度比较差异均有统计学意义(F=516.400、428.500、28.120,P<0.05)。不同单克隆细胞中的差异分析显示，4种载体在不同单克隆细胞中介导表达的EGFP荧光强度值的标准误差相比，从高到低依次为NANOG基因启动子在不同单克隆细胞中介导表达的EGFP荧光强度值标准误差、SOX2基因启动子在不同单克隆细胞中介导表达的EGFP荧光强度值标准误差、OCT4基因启动子在不同单克隆细胞中介导表达的EGFP荧光强度值标准误差、CMV基因启动子在不同单克隆细胞中介导表达的EGFP荧光强度值标准误差，且OCT4基因启动子与SOX2、CMV基因启动子在单克隆细胞中介导表达的EGFP平均荧光强度比较差异有统计学意义(t=3.070、4.360,P<0.05)。结论 带CpG岛的启动子能在转录后克服转基因沉默效应，带增强子的启动子具有克服位置效应的作用；二者的恰当组合可用于设计在哺乳动物细胞中高效稳定表达的启动子。
