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摘要
已知源于枯草芽孢杆菌内生孢子的Cot A蛋白具有漆酶和胆红素氧化酶活性。然而,其分离纯化极为困难。本研究对表达与纯化的重组Cot A蛋白的胆红素氧化酶特性及氧化还原功能进行鉴定。基因转染及筛选获得了表达Cot A的P.pastoris菌株;继而,表达的重组Cot A蛋白经DEAESepharose FF及Sephadex G-75层析分离与纯化,产物得率为25%,纯化产物的酶比活性为4 U/mg。经SDS-PAGE和MALDI-TOF MS分析显示,其分子质量为65 k D。纯化的Cot A蛋白能够催化胆红素氧化,生成胆绿素,且催化反应速率受反应溶液中溶解氧含量的影响,提示纯化的重组CotA具有胆红素氧化酶活性。酶反应进一步证明,Cot A的胆红素氧化酶反应最适p H值为p H 8.0,最适温度为60℃。该酶在90℃条件下的半衰期为7 h,提示Cot A胆红素氧化酶具有高度的热稳定性。Cot A修饰的摄谱仪石墨电极可直接电催化分子氧(O2)还原,具有很好的电流响应。我们的结果表明,重组的Cot A蛋白具有耐高温胆红素氧化酶活性。更重要的是,我们的结果还提示重组的Cot A蛋白在酶生物燃料电池阴极的制备上具有较好的应用潜能。
