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摘要
目的 检测前列腺癌细胞中环状核糖核酸（circular RNAs, CircRNA）100395基因启动子区甲基化状态及其表达水平，研究CircRNA-100395基因去甲基化对前列腺癌细胞增殖、侵袭的影响及作用机制。方法 选择人正常前列腺上皮细胞（RWPE）和前列腺癌细胞系（LNCap,PC3和DU145）进行研究。采用甲基化特异性聚合酶链式反应(methylation specific polymerase chain reaction, MSP)检测CircRNA-100395基因启动子区甲基化状态。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测上述细胞中CircRNA-100395 mRNA表达水平。应用去甲基药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷（AZA）处理LNCap细胞，检测AZA去甲基化处理前后细胞中CircRNA-100395表达水平。采用CCK-8和Transwell实验检测CircRNA-100395基因去甲基化前后LNCap细胞增殖和侵袭能力。构建CircRNA-100395野生型和突变型质粒，通过双荧光素酶报告分析CircRNA-10039与miRNA-136-5p之间的靶向关系；利用qRT-PCR检测CircRNA-10039与miRNA-136-5p表达水平，验证其调控关系。采用Westernblot法检测AZA去甲基化和miRNA-136-5p过表达对Smad3,p-Smad3蛋白表达的影响。结果 前列腺癌细胞中CircRNA-100395呈高甲基化状态；LNCap,PC3及DU145细胞中CircRNA-100395相对表达水平分别为0.39±0.08,0.65±0.14,0.62±0.10，显著低于RWPE(1.12±0.15)细胞中表达水平，差异有统计学意义（F=42.076,P <0.001）。经AZA去甲基化处理后，LNCap细胞中CircRNA-100395表达水平为1.02±0.17，较未处理LNCap细胞（0.42±0.05）明显升高，差异有统计学意义（t=5.808,P <0.01）。AZA去甲基化处理显著抑制了LNCap细胞的增殖能力（t=8.764～12.970，均P <0.001）、迁移能力（t=6.092,P <0.01）。miRNA-136-5可能是CircRNA-100395的下游靶基因。未经AZA处理前LNCap细胞中CircRNA-100395,miRNA-136-5p表达水平分别为0.39±0.08,0.87±0.15,AZA处理后两者表达水平分别为1.02±0.17,0.35±0.08，差异有统计学意义（t=5.808,5.298，均P <0.01）。AZA处理后Smad3和p-Smad3蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（t=7.394,11.889，均P <0.01）;miRNA-136-5p过表达抑制了Smad3和p-Smad3蛋白表达，差异有统计学意义（t=4.996,5.422，均P <0.01）。结论 CircRNA-100395基因启动子区的高甲基化状态可以抑制CircRNA-100395在前列腺癌细胞中的表达水平，去甲基化处理后CircRNA-100395表达恢复，并抑制前列腺癌细胞增殖和侵袭，其作用机制可能与CircRNA-100395靶向调控miRNA-136-5p/Smad3轴有关。
- 出版日期2022
- 单位来安家宁医院; 滁州市第一人民医院
