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摘要
该文基于一种可诱导的DD-Cas9系统构建敲除端粒酶TERC基因的人Calu3细胞模型,并对其功能进行验证。将靶向TERC序列的sgRNA克隆至载体pLenti-DD-Cas9-Flag上,慢病毒包装后感染Calu3细胞,对筛选获得的单克隆细胞添加小分子化合物甲氧苄啶(trimethoprim,TMP)药物诱导Cas9蛋白表达,实现对端粒酶RNA组分的敲除。单克隆细胞培养后鉴定其端粒酶活性、端粒长度的变化,并进行细胞衰老染色的实验。结果显示成功构建了pLenti-DD-Cas9-Flag-sgTERC重组质粒,并利用DD-Cas9高效、便捷的特点完成了对TERC基因的可诱导性编辑。测序结果表明，单克隆细胞中TERC序列部分敲除；TRAP实验显示端粒酶活性均有下调；提取细胞基因组用qPCR的方法进行端粒长度检测,结果显示其端粒长度明显缩短；同时,与野生型细胞相比较,TERC序列敲除的细胞出现明显衰老。总之,TERC基因的缺失导致细胞出现端粒酶活性下降、端粒长度缩短及衰老的现象,可诱导敲除端粒酶TERC基因的人Calu3细胞模型为后续对细胞衰老相关研究奠定了基础。
