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摘要
背景:LL-37作为唯一存在人体的抗微生物肽,不仅能促内皮细胞增殖,而且具有较强的促进血管生成能力,在组织修复初期的血管生成中起重要作用。目的:构建过表达人抗菌肽LL37基因的重组腺病毒,体外转染犬阴道上皮细胞,检测抗菌肽LL37的表达和分泌情况。方法:PCR法扩增LL37基因片段,构建融合绿色荧光蛋白(EGFP)和LL37的重组腺病毒表达质粒,限制性内切酶酶切和测序法鉴定构建的重组腺病毒表达质粒,采用HEK293包装后反复冻融扩增、纯化过表达LL37的腺病毒,终点稀释法检测腺病毒滴度。体外分离培养犬阴道上皮细胞,转染过表达LL37腺病毒,分别于转染后1,2,3,5和7 d采用荧光显微镜观察细胞转染情况,ELISA法测定细胞培养上清液中LL37的分泌表达情况。结果与结论:1限制性内切酶酶切鉴定与DNA测序证实成功构建了GV314-LL37腺病毒表达载体,包装纯化后腺病毒滴度达到3×109 pfu/m L;2犬阴道上皮细胞可在体外成功分离培养并稳定传代;3过表达LL37腺病毒可高效转染阴道上皮细胞,转染24 h后荧光显微镜下即可见绿色荧光蛋白表达,随时间延长表达逐渐增强,转染72 h时表达最强,转染效率达89%;4ELISA证实阴道上皮细胞转染过表达LL37腺病毒后表达分泌LL37,转染后细胞培养上清中LL37表达量显著高于空白组,表达呈时间依赖性,转染3 d表达最强,转染后7 d仍持续分泌表达;5结果说明,成功构建了过表达人抗菌肽LL37基因的重组腺病毒,转染犬阴道上皮细胞后高效表达分泌LL37,为构建具有抗感染能力和促血管生成的功能性组织工程化阴道奠定了基础。
- 出版日期2016
- 单位武汉大学人民医院
