APP/PS1ΔE9双转基因小鼠胚胎干细胞体外神经分化受损研究

作者：程飞

来源：硕士, 安徽大学, 2017.

• 阿尔茨海默病
• APP/PS1ΔE9转基因小鼠
• 胚胎干细胞
• 神经分化

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）,俗称老年痴呆,是一种神经系统退行性疾病,AD的主要临床表现为认知障碍、记忆力障碍、言语能力失调等,且常常伴有精神类疾病比如人格分裂、精神失常等。近年来,AD发病率上升,严重影响了长者的生活质量,构成严重的社会问题和经济负担。AD的发病机制复杂,研究困难,到目前为止,医学上还没有有效的治疗AD的药物和治疗方法。许多科学研究人员正在使用动物模型来研究AD的发病机制。作为广泛使用的动物模型APP/PS1ΔE9转基因小鼠,该小鼠能在大脑中产生大量的人类淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein,APP）和第九号外显子缺失的人早老素蛋白突变体1（Presenilin1AE9,PS1ΔE9）。PS1ΔE9可以选择性加速APP向有害Aβ42的形成,其能形成异常的纤维结构并且容易在纹状体中形成聚集和沉积,因此,APP/PS1ΔE9小鼠显示痴呆症状,是研究AD发病机制的良好动物模型。小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ES细胞）分离自着床前囊胚内细胞团（inner cell mass,ICM）。胚胎干细胞在不添加白血病抑制因子（Leukemia inhibitor factor,LIF）培养条件下可以形成胚状体,再添加视黄酸可以将胚状体诱导为神经细胞。本研究综合APP/PS1ΔE9转基因小鼠和胚胎干细胞特性来研究阿尔茨海默病的发病机制。概括如下:①APP/PS1ΔE9转基因雌雄小鼠交配,受精成功后,取3.5天的囊胚,除去透明带后,将囊胚培养在培养基中,该培养基补充有小分子抑制剂CHIR99021和LIF。一周后,20个囊胚中有9个显示出细胞生长克隆;挑取这些克隆并进行胰蛋白酶消化以用于进一步培养,所有细胞显示典型的胚胎干细胞形态,到此,转基因小鼠胚胎干细胞形态学检验完成,野生型作为对照。在本过程中有一个创新点,在常用的血清+LIF的培养条件下,转基因来源的小鼠胚胎干细胞会发生分化,加入小分子抑制剂CHIR99021则能维持多向分化潜能和维持自我更新。②对以上获得的细胞克隆进行基因型鉴定,结果有两条条带显示阳性结果,扩增条带有APP基因和PS1AE9基因;即AD胚胎干细胞系建立。野生型（wide type,WT）胚胎干细胞作为参照。③对WT和AD来源的胚胎干细胞用碱性磷酸酶进行细胞染色,WT ES和AD ES细胞都显示阳性结果,碱性磷酸酶染色均显示棕红色;对胚胎干细胞特异性的表达因子Oct4进行免疫荧光染色,结果为WT和AD胚胎干细胞均显示阳性结果,即两种胚胎干细胞均表达Oct4;再利用qRT-PCR技术分析证实WT ES细胞和AD ES细胞内多能性因子Oct4和Sox2的表达是相差不大的;此外,MTT测定显示ADES细胞的增殖速率与WT ES细胞增值速度相似;所有这些数据表明转基因APP和PS1ΔE9不影响小鼠ES细胞的自我更新。④ES细胞在体外可以分化为神经细胞,本研究中胚胎干细胞分化方法使用"4d-/4d + RA"方法。巢蛋白（Nestin）常常作为神经细胞和神经前体细胞的标记基因,在本研究中ADES和WTES细胞均表达巢蛋白,免疫荧光染色显示阳性结果,DAPI用于核定位;神经前体细胞标记基因为Nestin基因,Sox1基因和Musashi基因,利用qRT-PCR进行分析Nestin,Sox1和Musashi mRNA水平,结果显示在mRNA水平ADES细胞与WTES细胞水平相差不多;结果表明APP/PS1ΔE9转基因及其产物不会影响AD ES细胞产生神经前体细胞,综合以上结果表明AD ES和WT ES诱导产生神经前体细胞的效率基本相同。⑤Tuj1是成熟神经细胞的标记基因,免疫荧光染色显示WTES和AD ES细胞均分化为成熟神经细胞即Tuj1均荧光显色;成熟神经细胞标记基因:神经元特异性标记基因Tuj1,轴突特异性标记基因GAP43,树突状细胞特异性标记基因MAP2,星形胶质细胞特异性标记基因GFAP,突触前囊泡标记突触泡蛋白（Syn）和乙酰胆碱酯酶（AchE）,利用qRT-PCR分析成熟神经元相关基因Tuj1、GAP43、MAP2、GFAP、Syn、AchE。发现ADES 细胞分化的神经元以上相关基因的水平显著低于WT ES细胞分化的神经元中相关基因的水平,结果表明:APP/PS1ΔE9转基因小鼠来源的胚胎干细胞体外成熟神经元分化效率低,成熟神经元受到损害。综合以上所有结果,得出AD和WT来源的胚胎干细胞无显著差异,分化为神经前体细胞效率也基本相同,但是AD胚胎干细胞分化为成熟神经细胞受损,效率明显低于WT胚胎干细胞分化为成熟神经细胞,可以了解阿尔茨海默病的发病研究重点是在成熟神经元的形成过程。本研究最终得到了一个可以在体外研究阿尔茨海默病的发病机制以及药物筛选的细胞模型。

• 出版日期2017
• 单位安徽大学