过表达NICD通过下调基因JunB的表达抑制BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

作者：王南; 谭涛; 林端阳; 罗小辑^*

来源：重庆医科大学学报, 2018, 43(10): 1286-1291.

DOI：10.13406/j.cnki.cyxb.001463

• 骨形态发生蛋白9
• Notch信号通路
• 间充质干细胞
• 成骨分化

目的:研究Notch信号通路在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化过程中的作用及其机制。方法:将细胞分为5组:空白组(Blank,n=3),BMP9处理组(BMP9,n=3),空白质粒对照组(BMP9+Control,n=3),过表达Notch1胞内段质粒(Notch1 intracellular domain,NICD)处理组(BMP9+NICD,n=3),DAPT处理组(BMP+DAPT,n=3)。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和钙盐染色分别验证过表达NICD对成骨分化早晚期情况的影响。进一步采用定量逆转录PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-RCR)和Western blot检测基因NICD、Hey1及成骨相关基因Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8、OPN、Runx2、OCN、JunB的表达。结果:早期ALP活性及染色结果显示,NICD组较Control组能显著抑制C3H10T1/2细胞成骨分化过程中ALP的形成[5 d:(33 167.66±2 018.45)vs.(146 451.00±14 889.67),P=0.000;7 d:(58 981.33±4 724.70)vs.(89 588.66±5 928.32),P=0.000],γ-分泌酶抑制剂(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT)完全抑制Notch通路时得到相同的结果[5 d:(44 812.66±4 174.94)vs.(146 451.00±14 889.67),P=0.000;7 d:(64 622.93±4 724.70)vs.(89 588.66±5 928.32),P=0.000]。茜素红S染色结果显示,NCID抑制钙盐结节的形成,而DAPT阻断Notch通路明显促进钙盐结节形成。qRT-PCR结果表明,NCID组中NICD及靶基因Hey1的表达较Control组明显增加[(3.90±0.02)vs.(0.35±0.01),P=0.000;(19.79±0.01)vs.(11.80±0.02),P=0.000],Western blot得到相同结果[(1.32±0.01)vs.(0.19±0.01),P=0.000],且NICD明显抑制成骨分化相关基因JunB、Runx2、OCN、OPN等的表达[(0.10±0.01)vs.(0.53±0.01),P=0.000;(0.18±0.01)vs.(0.30±0.02),P=0.000;(0.36±0.01)vs.(0.62±0.02),P=0.000;(0.07±0.01)vs.(0.48±0.01),P=0.000],而转录因子Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8的表达不受影响[(0.74±0.02)vs.(0.73±0.03),P=0.000;(0.63±0.01)vs.(0.58±0.04),P=0.000],DAPT阻断Notch通路后上述相关基因的表达明显增加。结论:本实验结果首次证明,NICD激活Notch通路对BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的抑制作用可能是通过抑制JunB基因发挥作用,而非调控BMP9/Smad(bonemorphogenetic protein 9/drosophila mothers against decapentaplegic)信号通路。

• 出版日期2018
• 单位重庆医科大学附属第一医院; 第一临床学院; 重庆医科大学