基于热处理CRISPR/Cas9马铃薯植株的基因编辑体系优化

作者：熊文汶; 刘慧敏; 陈凯园; 杜鹃; 宋波涛^*; 景晟林^*

来源：园艺学报, 2023, 50(12): 2591-2600.

DOI：10.16420/j.issn.0513-353x.2022-1168

• 马铃薯
• 基因编辑
• CRISPR/Cas9
• StPDS
• 热处理

以二倍体马铃薯栽培种AC142和四倍体栽培种E3为试验材料，构建并优化了马铃薯内源启动子驱动的CRISPR/Cas9基因编辑体系。以控制白化表型的八氢番茄红素脱氢酶基因（StPDS）为靶标基因，通过农杆菌介导的遗传转化侵染试管薯，根据转化效率和表型突变频率的分析，筛选出马铃薯内源启动子StU6和StUBI10驱动的HM4载体为最优CRISPR载体。以常温处理为对照，对HM4获得的AC142的37个全绿株系和白绿嵌合株系、E3的4个全绿株系的侧芽进行循环8次的短期热处理（37℃24h+22℃24h）共15d，表型分析和测序检测表明，对敲除株系进行短期热处理能显著提高CRISPR/Cas9的编辑效率。常温下，AC142和E3敲除株系的表型突变频率分别为16.2%(6/37)和0(0/4)，循环8次短期热处理之后，表型突变频率分别提高到54.1%(20/37)和75%(3/4)。其中，AC142敲除株系的侧芽能得到10.8%(4/37)白化株系，而E3未能得到白化株系，只能得到75%(3/4)的白绿嵌合株系。4次连续15 d的短期热处理后，2.1%(3/144)的E3敲除株系的侧芽可在常温下保持白化。对短期热处理后的白化植株进行TA克隆，测序结果显示二倍体敲除株系CR-AC142-StPDS-17/21和四倍体敲除株系CR-E3-StPDS-3/4的8～12个单克隆都不存在野生型，说明本研究的敲除体系可在马铃薯中实现对靶标序列的完全诱导突变。该体系可广泛应用于马铃薯突变体的创制，为马铃薯基因功能组学研究和目标性状精准改良提供技术基础。

• 出版日期2023
• 单位园艺林学学院; 华中农业大学