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摘要
mapk-like是一种信号转导相关促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因,与线虫（Caenorhabditis elegans）中参与抵御Cry毒素的p38 MAPK含有类似的模序,其是否参与埃及伊蚊（Aedes aegypti）抵御苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）过程有待验证。为简便并大量获得RNAi验证所需的ds RNA,本研究利用RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌（Escherichia coli）HT115高效和廉价的优点,根据已测序的促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因mapk-like基因序列,设计特异性引物,PCR扩增大小为361 bp的目的片段mapk-like（Gen Bank登录号:AAEL003728-RA）,将其连接到克隆载体p MD18-T上,利用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ将其插入到原核表达载体p Litmus28i的2个T7启动子之间,成功构建可诱导形成目的双链RNA（ds RNA）的原核表达重组载体p Litmus28i-mapk-like,并转化大肠杆菌HT115,经IPTG诱导,1 m L菌液的ds RNA产量可达1.18μg,电泳检测条带清晰,质量良好。此外,利用壳聚糖包裹ds RNA形成纳米微粒,上清经电泳检测表明,壳聚糖的聚沉效率良好,纳米微球可有效防止ds RNA从饲料琼脂块中游离出来,提高ds RNA的稳定性。埃及伊蚊幼虫摄取mapk-like基因的ds RNA后,相对转录表达水平为65.55%,表达量明显下调,饲喂效果良好。研究结果将有利于进一步筛选获得相关抵御基因,为建立一个基于RNA沉默防治蚊媒病的研究体系提供了基础资料。
- 出版日期2014
- 单位农药与化学生物学教育部重点实验室; 福建农林大学
