NLRP3基因过表达载体的建立及鉴定

作者：汪涛; 刘慧; 雷蕾; 徐曼

来源：基因组学与应用生物学, 2017, 36(09): 3511-3515.

DOI：10.13417/j.gab.036.003511

• Nlrp3
• 过表达
• 非酒精性脂肪肝

本研究旨在构建携带小鼠nlrp3蛋白的过表达真核载体。首先从高脂饮食喂养3个月的C57BL/6J小鼠上剪取肝脏组织,液氮冻存。快速剪取适量肝脏组织,冰上研磨,Trizol法提取总RNA,逆转录获得c DNA,然后PCR扩增nlrp3基因的编码区。PCR产物电泳回收,经过NotⅠ及NheⅠ双酶切后,将其克隆到真核表达载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP-T2A-Puro中。重组质粒电转进入感受态DH5α,过夜培养后挑取单个菌落过夜扩大培养。然后提取质粒,酶切鉴定后测序。将克隆成功的重组质粒转染HEK293T细胞,培养3 d后收集细胞蛋白,用Western blotting检测nlrp3的表达水平,研究显示,重组质粒p CDH-NLRP3较空白质粒p CDH-NULL的nlrp3蛋白表达水平明显增加(p<0.01)。本研究成功构建了nlrp3过表达载体,为进一步研究其作用机制提供了基础工具。

• 出版日期2017
• 单位重庆医科大学; 基础医学院