敲减心磷脂酰基转移酶1对肝细胞脂肪变和氧化应激的影响及其机制

作者：胡晓娜; 董方元; 姜鑫; 纪雪莹; 陈洁; 于晓峰; 保志军^*

来源：中华消化杂志, 2020, 40(08): 546-554.

• 氧化性应激
• 心磷脂酰基转移酶1
• 肝细胞脂肪变
• 自噬

目的探讨心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)对脂肪肝细胞模型中肝细胞脂肪变和氧化应激的影响及其作用机制。方法以游离脂肪酸(FFA;亚油酸和棕榈酸混合物)诱导建立脂肪肝细胞模型,采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测ALCAT1在脂肪肝细胞模型中的表达情况。构建空载小干扰RNA(siRNA)质粒和ALCAT1 siRNA质粒。以空载siRNA质粒转染人正常肝细胞(L-02细胞)24 h,然后与FFA共培养24 h,设立脂肪肝细胞模型组;以ALCAT1 siRNA质粒转染L-02细胞24 h,然后与FFA共培养24 h,设立ALCAT1干预组;以常规培养基培养的L-02细胞作为空白对照组。在透射电子显微镜下观察各组的脂滴沉积、线粒体形态,采用蛋白质印迹法测定自噬体标志物微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、酵母ATG6同源物(Beclin1)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路关键蛋白mTOR和磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)的表达水平,采用ELISA法测定氧化应激产物丙二醛、4-羟基壬烯醛(4-HNE)、活性氧和炎症因子IL-6、TNF-α的表达。采用独立样本t检验进行统计学分析。结果脂肪肝细胞模型中ALCAT1的mRNA和蛋白质的表达水平均高于阴性对照组(9.26±0.83比1.02±0.12、0.35±0.02比0.17±0.01),差异均有统计学意义(t=9.82、6.83,P均<0.05)。透射电子显微镜结果显示,脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的脂滴沉积量均高于空白对照组(17.67±3.52和7.67±0.33比4.33±0.33),ALCAT1干预组脂滴沉积量低于脂肪肝细胞模型组(7.67±0.33比17.67±3.52),差异均有统计学意义(t=3.76、7.07、2.82,P均<0.05);脂肪肝细胞模型组线粒体肿胀程度高于空白对照组,而ALCAT1干预组线粒体肿胀程度低于脂肪肝细胞模型组。蛋白质印迹法结果显示,脂肪肝细胞模型组的LC3-Ⅱ表达水平高于空白对照组(0.43±0.01比0.28±0.02),差异有统计学意义(t=7.32,P<0.05);脂肪肝细胞模型组的Beclin1表达水平与空白对照组比较(0.93±0.05比0.98±0.05),差异无统计学意义(P>0.05);ALCAT1组的LC3-Ⅱ、Beclin1表达水平均高于脂肪肝细胞模型组和空白对照组(0.95±0.04比0.42±0.01和0.28±0.02、2.07±0.06比0.93±0.05和0.98±0.05),差异均有统计学意义(t=13.30、15.63、14.05、13.02,P均<0.05)。脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的mTOR表达水平均低于空白对照组(1.44±0.02和0.74±0.01比1.93±0.10),ALCAT1干预组mTOR的表达水平低于脂肪肝细胞模型组(0.74±0.01比1.44±0.02),差异均有统计学意义(t=4.83、12.04、32.14,P均<0.05);脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的磷酸化AKT的表达水平均低于空白对照组(0.14±0.01和0.07±0.01比0.28±0.01),ALCAT1干预组磷酸化AKT的表达水平低于脂肪肝细胞模型组(0.07±0.01比0.14±0.01),差异均有统计学意义(t=8.59、14.10、5.96,P均<0.05)。ELISA检测结果显示,脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的活性氧、丙二醛、4-HNE、IL-6和TNF-α的表达水平均高于空白对照组[(11.44±0.30)和(5.84±0.36) g/L比(1.72±0.38) g/L、(19.94±2.47)和(11.95±1.55) μmol/L比(1.47±0.18) μmol/L、(5.00±0.43)和(2.99±0.37) ng/L比(1.46±0.23) ng/L、(203.40±5.16)和(92.07±11.98) ng/L比(23.32±3.33) ng/L、(123.70±8.38)和(67.42±4.88) ng/L比(47.18±4.57) ng/L],差异均有统计学意义(t=19.86、7.86、7.45、6.74、7.22、3.49、29.34、5.53、8.02、3.03,P均<0.05)。ALCAT1干预组的活性氧、4-HNE、IL-6和TNF-α的表达水均低于脂肪肝细胞模型组[(5.84±0.36) g/L比(11.44±0.30) g/L、(2.99±0.37) ng/L比(5.00±0.43) ng/L、(92.07±11.98) ng/L比(203.40±5.16) ng/L、(67.42±4.88) ng/L比(123.70±8.38) ng/L],差异均有统计学意义(t=11.99、3.51、8.54、5.81,P均<0.05);ALCAT1干预组丙二醛的表达水平与脂肪肝细胞模型组比较[(11.95±1.55) μmol/L比(19.94±2.47) μmol/L],差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ALCAT1在脂肪肝细胞模型肝细胞中表达上调,敲减ALCAT1可抑制mTOR通路相关蛋白的表达,激活自噬,减轻肝细胞脂肪变、氧化应激和炎症反应。

• 出版日期2020
• 单位华东医院; 复旦大学