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摘要
硫酯酶(thioesterase,TE)具有区域定向性(regiospecific)、化学定向性(chemospecific)及立体定向性(stereospecific)的特点。这些特性决定了TE作为生物催化剂(biocatalysis)在工业生产中具有较高的应用价值和广阔的应用前景。Mcy C TE(microcystin thioesterase,Mcy C TE)来自铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)NRPS/PKS生物合成基因簇。我们利用正交试验提高Mcy C TE表达量,得到稳定的诱导表达条件,并结合成熟的线性多肽化学合成法对其底物适用性做了进一步研究。得到的最佳诱导表达条件为:诱导时机2 h,诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside,IPTG)浓度0.75 mmol/L,诱导时间6 h,诱导转速210 r/min,诱导温度20℃,使TE的表达量由8.75 mg/L提高至22.15 mg/L,时间缩短了6.5 h。TE表达量的大幅度提升和表达时间的缩短为将来酶的结构及催化机制研究奠定了基础。TE底物适用性研究结果发现:Mcy C TE并不遵循"4 n+2原则";底物中转角过多不仅不利于环肽的形成,更可能形成卷曲影响环化;无D型氨基酸亦可通过加入其它位阻较小较灵活的Gly或者自带天然转角Pro的可弱化肽链的刚性,促进催化反应;含苯环的Phe的引入在一定程度上阻碍了环化;底物无肽链氨基酸数目奇偶性的选择;延长多肽链长度也可环化,Mcy C TE的底物容忍度较大,使天然多肽药物筛选范围增大,也为增强天然多肽药物药效增加了改良方案,为进一步研究Mcy C TE的催化功能提供了实验基础。
