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摘要
目的 通过CRISPR/Cas9技术将水熊虫Dsup基因定点敲入胚胎干细胞（hESC-H9）的AAVS1位点，构建Dsup基因过表达的稳定细胞株，研究Dsup表达对hESC-H9生物学性质的影响。方法 构建CRISPER/Cas9 AAVS1位点敲入系统，采用PCR技术扩增Dsup序列，并将其插入pAAVS1-Donor-GFP-Puro中，将构建的pAAVS1-Dsup-GFPPuro与pAAVS1-CRISPR-Cas9载体共同转染hESC-H9，通过CRISPER/Cas9技术介导的同源重组使Dsup基因插入hESC-H9的AAVS1位点，在嘌呤霉素筛选后利用流式分选技术分选GFP、Tra-1-60、SSEA-4等3种荧光标记阳性的细胞群，获得稳定敲入Dsup基因并保持干性的细胞。将获得的hESC-H9-Dsup传至第9代，对Dsup mRNA表达水平、GFP、细胞表面干性标志物（Tra-1-60、SSEA-4）以及干性基因（OCT4、SOX2、NANOG）检测，并研究hESC-H9-Dsup的增殖、凋亡以及辐射耐受情况，以探索Dsup基因对hESC-H9生物学活性的影响。结果 成功构建pAAVS1-DsupGFP-Puro重组供体质粒，与pAAVS1-CRISPR-Cas9质粒共同转染hESC-H9后通过药物筛选获得了在AAVS1位点敲入的hESC-H9-Dsup。经实时定量PCR检测，Dsup mRNA在hESC-H9-Dsup中成功表达，且其表达对hESC-H9表面干性标志物Tra-1-60、SSEA-4以及干性基因OCT4、SOX2、NANOG表达未见明显影响。hESC-H9-Dsup增殖速度稍高于hES-H9-Control/WT。hESC-H9-Dsup与hESC-H9-Control/WT凋亡无显著差异（P＞0.05），但hESC-H9-Dsup的辐射耐受能力显著高于hESC-H9-Control（P＜0.001）。结论 成功构建了hESC-H9-Dsup,Dsup基因表达未对其生物学性质产生明显影响，且表现出明显的辐射耐受能力，为后续研究Dsup基因对人类细胞的影响及探讨可能的应用价值奠定了基础。
- 出版日期2022-10-19
- 单位华南生物医药研究院
